米氏常数测定时的要求有要在沸水浴1min终止反应而后再加入NAOH。米氏常数是研究酶促反应动力学最重要的常数。它的意义如下：它的数值等于酶促反应达到其最大速度Vm一半时的底物浓度〔S〕。它可以表示酶和底物之间的亲和能力，Km值越大，亲和能力越弱，反之亦然。
米氏常数可以确定一条代谢途径中的限速步骤：代谢途径是指由一系列彼此密切相关的生化反应组成的代谢过程，前面一步反应的产物正好是后面一步反应的底物，例如EMP途径。限速步骤就是一条代谢途径中反应最慢的那一步，也就是Km值最大的那一步，该酶也叫这条途径的关键酶，它可以用来判断酶的最适底物。