基因克隆的基本步骤

1、不知道大家对基因克隆方面的技术了解多少，经过较长时间的总结和实践，有了一些自己的体会，拿出来与大家分享一下，给大家做一个抛砖引玉的作用吧。

2、(1)是酶切位点的选择. 我的实验室有三种常用的酶,在设计PCR产物的酶切位点之前首先要看看哪两个酶之间是可以进行同时酶切的.因为这三家公司的双酶切表的组合完全不同,最佳的方案是我们能够按照需要去选择合适的酶.(2)PCR引物的设计。

3、 做过实验的战友都清楚,有的时候很多PCR引物的选择是没有选择的,如果实在是没办法的条件下,只能在PCR引物的5端加入人为设计的碱基而把引物的扩增部分后移或前移来避开难以扩增的部位,我不知道说清楚没有,如果引物序列OK,可以忽略上句话.所以大多数情况下引物我们是没得选择的,那么我们只能从PCR扩增条件上下功夫.(3)PCR扩增 对于PCR扩增其实不同的基因可能策略不同.首先很多新手会忽略引物的浓度问题,把PCR的实验条件进行了全方位优化,50ul体系中buffer 5ul、Mg2+ 1mM、dNTP 0.2mM、引物每支1ul(配成10umol/L浓度)、PCR酶一般是0.5ul、其余部分用水补平,混匀,离心一下,进行PCR扩增.其中引物从公司拿到干粉后我一般用水溶解至100umol/L浓度保存,吸取少量稀释十倍后用于PCR反应,这个浓度是最佳的.所以PCR体系中引物并不是越多越好,同样的模板的量也很关键,一般我都在10ng-100ng之间,太少或太多都会抑制PCR反应.当然,不同的基因其退火温度差异较大,建议第一次做直接做梯度PCR,设置的温度范围宽些,总会有扩出来的.反正把反应体系加好把温度控制好,如果这样仍然扩不出来,那就直接调整DNA模版的量吧,其他的因素应该不是原因(当然得保证引物,以及酶的质量得前提下).(4)PCR产物的酶切,我认为PCR产物切得尽可能的充分对克隆很重要,毕竟保护性碱基只有几个.(5)质粒的酶切.虽然质粒的酶切很简单但是却很讲究,决定着克隆的成败.质粒提取我一般都用试剂盒,质粒提取完毕后我会用紫外分光光度法对质粒进行定量测定,根据A260的值计算出质粒的量,然后再进行酶切,一般酶切体系60ul,60ul体系中我只切总量1ug的质粒,一次切两管,酶切过夜后切胶回收或者不切胶直接回收,这取决于两个限制性内切酶之间的距离,十几bp以内我就直接回收了,如果偏大就要切胶回收.(6)连接连接我采用的是Promega公司的T4 DNA连接酶,它的特点是22度连接三小时以上几款,这样我就可以在上午把质粒片段以及PCR片段回收后马上做连接,连接一个白天到下午可以做转化了,涂板,过夜培养第二天早上看结果.然后挑克隆(一般我一个基因就挑四个克隆足已)培养一白天,下午稍晚些提质粒,然后马上酶切鉴定,一般酶切鉴定体系中我都做20ul体系,酶用0.5微升就够了(呵呵,该省的就省点吧),酶切一个小时跑胶就可以知道克隆是否成功了.这样从PCR到克隆鉴定完毕,一共三天.这个是个人在基因克隆。