pcr实验流程图(pcr实验程序)
pcr实验流程图(pcr实验程序)
1、1/4 在冰浴中,按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。
pcr实验流程图(pcr实验程序)
2、 10×PCR buffer 5 μl dNTP mix (2mM) 4 μl 引物1(10pM) 2 μl 引物2(10pM) 2 μl Taq酶 (2U/μl) 1 μl DNA模板(50ng-1μg/μl) 1 μl 加ddH2O至 50 μl 视PCR仪有无热盖,不加或添加石蜡油。
3、2/4调整好反应程序。
4、将上述混合液稍加离心,立即置PCR仪上,执行扩增。
5、一般:在93℃预变性3-5min,进入循环扩增阶段:93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s,循环30-35次,最后在72℃ 保温7min。
pcr实验流程图(pcr实验程序)
6、 3/4 结束反应,PCR产物放置于4℃待电泳检测或-20℃长期保存。
7、4/4PCR的电泳检测:如在反应管中加有石蜡油,需用100μl氯仿进行抽提反应混合液,以除去石蜡油;否则,直接取5-10μl电泳检测。
8、 PCR反应体系的组成与反应条件的优化 PCR反应体系由反应缓冲液(10×PCR Buffer)、脱氧核苷三磷酸底物(dNTPmix)、耐热DNA聚合酶(Taq酶)、寡聚核苷酸引物(Primer1,Primer2)、靶序列(DNA模板)五部分组成。
9、各个组份都能影响PCR结果的好坏。
10、 反应缓冲液:一般随Taq DNA聚合酶供应。
11、标准缓冲液含:50mM KCl,10mM Tris-HCl(pH8.3室温),1.5mM MgCl2。
12、Mg2+的浓度对反应的特异性及产量有着显著影响。
13、浓度过高,使反应特异性降低;浓度过低,使产物减少。
14、在各种单核苷酸浓度为200μM时,Mg2+为1.5mM较合适。